Stefan Hell hat mit einer genialen Idee einen Weg gefunden, die eigentlich als hart angesehene Auflösungsgrenze in der Fluoreszenzmikroskopie um zwei Größenordnungen zu überschreiten. Dafür wurde er 2014 gemeinsam mit zwei Kollegen mit dem Chemienobelpreis ausgezeichnet. Auf Einladung der Österreichischen Akademie der Wissenschaften (ÖAW) hielt Hell am 11. Oktober eine Richard Zsigmondy-Lecture im Rahmen der Akademievorlesungen im Kuppelsaal der Technischen Universität (TU) Wien. Im Interview erklärt der Direktor an den Max-Planck-Instituten für biophysikalische Chemie und für medizinische Forschung, was Fluoreszenzmikroskope heute können und wo (noch) die Grenzen liegen.
Molekular scharf
Ihr Vortrag in Wien lautet „molekular scharf“. Wie wörtlich darf man das nehmen?
Stefan Hell: Die Grenzen in der Lichtmikroskopie existierten lange vor allem in den Köpfen der Menschen. Heute haben wir die letzte Grenze überwunden: Wir können in der Fluoreszenzmikroskopie auf molekularer Skala auflösen. Als Physiker sage ich natürlich, dass die Grenze für die Unterscheidung einzelner Strukturen bei ein bis zwei Nanometer liegt, das ist die Größe der Fluoreszenzmoleküle selbst, die wir brauchen, um zum Beispiel Proteine oder andere Biomoleküle sichtbar zu machen.
Heute haben wir die letzte Grenze überwunden: Wir können in der Fluoreszenzmikroskopie auf molekularer Skala auflösen.
Lange galt es als unmöglich für Lichtmikroskope, eine bestimmte Auflösung, das sogenannte Abbe-Limit, zu unterschreiten. Was hat sich geändert?
Hell: Lange dachte man, dass für die Mikroskopie mit frei propagierendem Licht die Auflösungsgrenze bei etwa einer halben Wellenlänge liegt. Einige Forscher/innen hatten zwar Ideen für Tricks, um diesen Wert geringfügig zu verbessern. Die konzeptionelle Grenze bestand aber weiterhin, weil man glaubte, dass das Unterscheiden zweier oder mehrerer beieinander liegender Objekte nur über den Prozeß des Fokussierens gemacht werden kann. Wenn man mit Fokussieren, also mit Lichtbündelung, versucht zu unterscheiden, ist eine halbe Wellenlänge dann tatsächlich eine harte Grenze.
Bestechend einfach
Sie haben mit Kollegen einen Weg gefunden, dieses Limit zu umgehen. Worin liegt der Trick?
Hell: Ich habe als Erster realisiert, dass die Trennung von zwei nah beieinander liegenden Molekülen auch über deren Molekülzustände funktionieren kann. Wenn wir Moleküle durch ihre Zustände unterscheiden können, sind wir nicht auf eine Unterscheidung mithilfe der Lichtfokussierung angewiesen. Es war von Anfang an klar, dass man mit einem solchen Ansatz bis in den molekularen Bereich vorstoßen kann, auch wenn es noch viele technische Probleme auszuräumen gab. Mittlerweile sind 25 Jahre vergangen und wir wissen heute sehr genau, wie wir das zu machen haben.
Ich habe als Erster realisiert, dass die Trennung von zwei nah beieinander liegenden Molekülen auch über deren Molekülzustände funktionieren kann.
Diese Idee klingt bestechend einfach.
Hell: Das ist sie auch. Ich glaube, dass große Sprünge in der Physik oft gekennzeichnet sind durch ihre konzeptionelle Einfachheit, zumindest retrospektiv. Wir haben keine neue Physik gebraucht für unseren Durchbruch. Die entscheidende Idee war, Objekte nicht über fokussiertes Licht zu trennen, sondern über die Zustände der einzelnen Moleküle. Deshalb spielt für unser Mikroskopieverfahren die Wellenlänge auch so gut wie keine Rolle.
Diese Trennung wird mithilfe von fluoreszierenden Molekülen erreicht?
Hell: Ja, wir sprechen von Fluoreszenzmikroskopie. Das heißt, wir markieren die Objekte, also die Moleküle, die wir betrachten wollen, mit fluoreszierenden Molekülen, die wir dann zum Leuchten bringen.
Warum haben Sie sich auf die Fluoreszenzmikroskopie spezialisiert?
Hell: Ich habe Ende der Achtziger- und Anfang der Neunziger-Jahre die Fluoreszenzmikroskopie nicht gewählt, weil ich sie für besonders wichtig erachtet habe. Ich dachte einfach, dass ich in diesem Bereich eine Chance hatte, meine Idee umzusetzen. Mit Fluoreszenz ist es einfach, Moleküle in verschiedene Zustände zu bringen. Dass aufgrund ihrer eminenten Bedeutung in den Lebenswissenschaften 80 bis 90 Prozent der Anwendungen von Lichtmikroskopie mit hoher Auflösung auf diese Methode setzen, das war ein glücklicher Zufall.
Moleküle An- und Auschalten
Werden die verschiedenen Zustände über verschiedene Farben realisiert?
Hell: Das wäre prinzipiell möglich, ist aber in der Umsetzung schwierig. Wir nutzen eine viel einfachere Idee: Ein Molekül kann entweder leuchten oder nicht. Es gibt nur zwei Zustände – „An“ und „Aus“ – die wir benutzen. Wir haben als erste nachgewiesen, dass sich die Auflösungsgrenze für Fluoreszenzmikroskopie auf diese Weise aufheben lässt. Wenn zwei Moleküle näher beieinander liegen als die Beugungsgrenze von Licht, können wir sie immer noch unterscheiden, wenn nur eines der beiden leuchtet. Wir bringen die Moleküle in einer Probe hintereinander zum Leuchten und können dadurch jedes getrennt wahrnehmen, so dass wir ein Bild aus hintereinander aufgenommenen Molekülen zusammensetzen können. Technisch haben wir zwei Laserstrahlen, einer schaltet die Fluoreszenz an und der andere schaltet sie aus, sodass nicht alle an sind. In der Praxis ist es etwas komplizierter, aber das ist die grundlegende Idee.
Große Sprünge in der Physik sind oft gekennzeichnet durch ihre konzeptionelle Einfachheit, zumindest retrospektiv. Wir haben keine neue Physik gebraucht für unseren Durchbruch.
Wie hat sich die Technik weiterentwickelt?
Hell: Auch MINFLUX, unser neustes Verfahren, basiert auf demselben Prinzip. Das Verfahren kombiniert ältere Ansätze und steigert die Auflösung gegenüber der STED-Mikroskopie, dem ersten beugungsunbegrenzten Verfahren, nochmals um den Faktor 10. Damit sind wir jetzt schon um den Faktor 100 über dem Abbe-Limit.
Was kann ein Fluoreszenzmikroskop der neusten Generation?
Hell: Damit kann man etwa einzelne Proteine in den Synapsen von Nervenzellen beobachten. Es werden Fluoreszenzmoleküle an die Proteine geheftet, die sie für unser Verfahren sichtbar machen. Man darf nicht vergessen: wir erfassen immer nur die Fluoreszenzmoleküle, und die Proteine werden dadurch indirekt sichtbar. Jedes Protein ist normalerweise ein paar Nanometer groß, eine Synapse misst etwa 200 Nanometer und könnte mit fokussiertem Licht nicht scharf aufgelöst werden.
Neue Felder in der Biologie
Wo liegt das größte Potenzial solcher Mikroskope?
Hell: Dieser Fortschritt ist fundamental. Seit ein bis zwei Jahren können wir Moleküle auf molekularer Skala trennen, also auf ihrer eigenen Größenskala. Da werden sich vor allen Dingen für die Biologie neue Felder auftun. Alles, was wir mit Fluoreszenzmolekülen markieren können, können wir indirekt sehen. Das sind oft biologische Strukturen, aber es gibt wohl auch Anwendungen in der Polymerforschung oder in der Soft-Matter-Physik. Ich habe mit Studierenden eine Firma gegründet, Abberior Instruments GmbH, und diese molekular auflösenden MINFLUX-Mikroskope auf den Markt gebracht.
Man kann etwa einzelne Proteine in den Synapsen von Nervenzellen beobachten. Jedes Protein ist normalerweise ein paar Nanometer groß, eine Synapse misst etwa 200 Nanometer und könnte mit fokussiertem Licht nicht scharf aufgelöst werden.
Welche Limitationen gibt es?
Hell: Die Fluoreszenzhelligkeit selbst bringt mittlerweile fast keine Limitierungen. Was wir immer brauchen, sind Farbstoffe, die wir ein- und ausschalten können. Derzeit gibt es drei bis fünf Sorten davon, aber es wird durch chemische Synthese daran gearbeitet, mehr zu finden.
Lassen sich auch Strukturen in lebenden Zellen markieren?
Hell: Aber sicher. Das ist ja die Stärke: wir können auch lebende Zellen markieren. Das Licht, das wir benötigen, um die Fluoreszenzmoleküle anzuregen, ist nicht mehr so intensiv wie bei älteren Methoden. Das war früher ein Problem, weil die Fluoreszenzmoleküle bei starkem Licht toxisch werden können. Forscher konnten bis vor Kurzem die Auflösung auch deshalb lange nicht weiter verbessern, weil entweder die Zellen oder die Fluoreszenzmoleküle zu früh kaputt gegangen sind.
Aus der Perspektive der Grundlagenforschung ist das Thema wohl durch. Aber wer weiß, vielleicht kommt da nochmal eine Idee, die wieder alles auf den Kopf stellt.
Weiter verbessern lässt sich die Auflösung auf diesem Weg jetzt nicht mehr. Was heißt das für den Grundlagenforscher?
Hell: Mir ging es in meiner Arbeit immer um die intellektuelle Herausforderung. Es stimmt, hier ist eine fundamentale Grenze erreicht. Die Technik lässt sich zwar noch weiterentwickeln, wie zum Beispeil schneller machen, aber das grundlegende Limit ist wohl nur schwer zu überwinden. Aus der Perspektive der Grundlagenforschung ist das Thema wohl durch. Aber wer weiß, vielleicht kommt da nochmal eine Idee, die wieder alles auf den Kopf stellt. Auch Abbe hat vor 130 Jahren in weiser Voraussicht nicht ausgeschlossen, dass seine fundamentale Grenze umgangen werden könnte.
Ihr Vortrag in Wien ist eine Richard Zsigmondy Lecture. Haben Sie einen Bezug zu Zsigmondy?
Hell: Ich arbeite in Göttingen. Dort liegt Zsigmondy begraben. Er hat ebenfalls den Chemie-Nobelpreis bekommen und unter anderem ein Dunkelfeldmikroskop entwickelt. Ich mag seine Anmerkung, dass wir Dinge nicht deshalb nicht sehen können, weil sie im Lichtmikroskop so klein sind, wie viele seiner Zeitgenossen gedacht haben, sondern weil wir ihre Details nicht im Lichtmikroskop trennen können. Heute, hundert Jahre später, können wir auch das, vorausgesetzt die Details lassen sich mit Fluoreszenzmolekülen kontrastieren.
